Trombofilia związana z chromosomem X ze zmutowanym czynnikiem IX (czynnik IX Padua) ad

Bezpośrednie wykrycie mutacji czynnika IX-R338L przeprowadzono za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) (startery: sensowny, 5 -GCCAATTAGGTCAGTGGTCC-3 , odwrotny, 5 -GATTAGTTAGTGAGAGGCCCTG-3 ), po czym przez trawienie endonukleazą TaqI. Rekombinowany czynnik IX
Ludzkie zarodkowe komórki nerki 293 były transdukowane przez wektory lentiwirusa, które eksprymowały czynnik IX typu dzikiego lub czynnik IX z substytucją leucyny dla argininy w pozycji 338 (R338L) z zastosowaniem układu ekspresyjnego ViraPower HiPerform (Invitrogen). Substytucję R338L (CGA . CTA) wprowadzono przy użyciu zestawu do mutagenezy ukierunkowanej na stronie QuikChange II XL (Stratagene). Pożywki hodowlane składały się ze zmodyfikowanej pożywki Eagle a Dulbecco zawierającej 10% surowicy płodowo-cielęcej i 6 .g na mililitr witaminy K. Stężenie czynnika IX oznaczano przy użyciu testu immunoenzymatycznego 10. Funkcjonalną aktywność czynnika IX mierzono w sposób testu krzepnięcia za pomocą testu zmodyfikowanego jednoetapowego czynnika11. W celu ustalenia udziału czynnika IX w pomiarach czasu aktywowanej częściowej tromboplastyny pożywki kondycjonowanej z komórek transdukowanych lentiwirusem, oznaczenie czasu częściowej tromboplastyny po aktywacji przeprowadzono przed i po inkubacji w 37 ° C przez 30 minut z 2,5% oczyszczonym przez powinowactwo kozim antyludzkim czynnikiem IX (Cedarlane Laboratories).
Wyniki
Testy skriningu i trombofilii
Rycina 1. Rycina 1. Genotyp czynnika IX pacjenta i jego rodziny. Panel A pokazuje rodowód rodowy. Proband (II-1) jest oznaczony strzałką. Panel B pokazuje sekwencję genu czynnika IX wokół miejsca mutacji w eksonie 8. Transwersja AG . T przy nukleotydzie 31134 wystąpiła w Padwie czynnika IX, powodując substytucję aminokwasu leucyny dla argininy w pozycji 338. Proband jest hemizygotyczny pod względem mutacji (patrz strzałka we wstawce sekwencji). Panel C pokazuje analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych (RFLP) produktu reakcji łańcuchowej polimerazy egzonu 8 genu czynnika IX trawionego przez endonukleazę TaqI. Dziki czynnik IX wykazuje trzy fragmenty 304, 258 i 145 par zasad (bp). Mutacja Padua czynnika IX likwiduje jedno miejsce cięcia, w wyniku czego powstają tylko dwa fragmenty (562 i 145 bp). Panel D pokazuje specyficzną aktywność rekombinowanego czynnika IX typu dzikiego i czynnika IX-R338L. Przeprowadziliśmy eksperymenty aktywności specyficznej dla czynnika IX w ludzkich embrionalnych komórkach nerkowych 293 w trzech powtórzeniach i obliczyliśmy aktywność swoistą dla czynnika IX, dzieląc aktywność krzepnięcia przez poziomy antygenu i wyrażając wyniki w jednostkach na miligram. Ciemnoniebieskie słupki pokazują średnie aktywności właściwej dla czynnika IX typu dzikiego i dla trzech linii komórkowych wyrażających czynnik IX-R338L. Jasnoniebieskie słupki pokazują wyniki inkubacji kondycjonowanej pożywki z przeciwciałem przeciwko czynnikowi IX przed pomiarem aktywności krzepnięcia czynnika IX. Aktywność krzepnięcia czynnika IX mierzono w obecności przeciwciał przeciwko ludzkiemu czynnikowi IX (+ ahFIX) i pod ich nieobecność (-AHFIX) w pożywce hodowlanej. MW oznacza masę cząsteczkową.
Próbki z probanda i członków rodziny (dla rodowodu rodzinnego, patrz Figura 1A) zawierały normalne poziomy białka C, białka S i antytrombiny
[patrz też: dentysta bydgoszcz, dentysta płock, długi weekend czerwcowy ]

Powiązane tematy z artykułem: dentysta bydgoszcz dentysta płock długi weekend czerwcowy